嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(R/R
DLBCL)中疗效显著。尽管CAR-T疗法在DLBCL患者中取得了显著成功，但仍面临挑战，如成本高、部分患者仅达到部分缓解(PR)或治疗失败、潜在的严重副作用(如细胞因子释放综合征[CRS]和免疫效应细胞相关神经毒性综合征[ICANS])。
在CAR-T细胞疗法中，T细胞功能对于识别和消除肿瘤细胞是至关重要的。但已有研究证实CAR-T细胞在某些情况下表现出较差的T细胞功能，从而导致疗效下降，最终使患者临床结局不佳。基于此，北京协和医院周道斌教授、张薇教授团队采用单细胞测序技术和Illumina甲基化EPIC
850k Beadchip检测了R/R DLBCL患者输注靶向CD19
CAR-T细胞前后的外周血样本，以鉴定T细胞功能对CAR-T细胞疗法疗效的影响以确定与临床结果相关的T细胞克隆动力学、转录程序和甲基化模式特征。
研究方法
该研究招募了2021年10月-2022年12月在北京协和医院接受靶向CD19 CAR-T治疗的16例R/R
DLBCL患者。其中，5例患者接受了CAR-T细胞输注前后(第14天和28天)外周血样本的单细胞转录组测序分析，13例患者在CAR-T细胞输注前，接受了外周血CD3+T细胞的甲基化芯片阵列检测。依据CAR-T细胞输注1个月后的疗效评估结果，研究者将患者分为两组：完全缓解(CR)组和非完全缓解(non-CR)组。
研究结果
患者临床特征
所有患者(n=16)的中位年龄为58.5岁(43-64岁)，男性10例，女性6例。3例(18.8%)患者Ann
Arbor分期为II期，3例(18.8%)为III期，10例(62.5%)为IV期。3例(18.8%)为生发中心B细胞样型(GCB)，13例(71.2%)为活化B细胞样(ABC)。7例(43.8%)国际预后指数(IPI)≤2。1例(6.3%)在CAR-T细胞输注前接受了自体造血干细胞移植(ASCT)。10例(62.5%)在输注后出现了1-2级CRS，3例(18.8%)出现了ICANS。所有患者的临床特征见表1。
表1.所有患者的临床特征
单细胞转录组和甲基化分析结果
在5例接受单细胞转录组检测的患者中，3例达到CR。1例患者在输注后1个月时被评估为PR，在输注后3个月时达到CR。1例患者因疾病进展死亡，因此在第28天未获得外周血样本。研究者对5例患者CAR-T治疗前后的15份外周血单个核细胞(PBMC)样本进行了单细胞转录组测序。UMAP聚类分析和细胞类型注释结果表明，PBMC被注释为8种细胞类型，包括T细胞(CD3D，CD3G，CD2)，髓系细胞(CD68)，树突状细胞(DC;CD1C，CD1E)，浆细胞样树突状细胞(pDC;LILRA4)、中性粒细胞(FCGR3B、CSF3R)、未成熟中性粒细胞(LTF)、巨核细胞(PPBP)和肥大细胞(MS4A2)，具体见图1A、B。最多的细胞类型为T细胞(54%)，其次为单核细胞(24%)和中性粒细胞(17%)。与非CR组相比，CR组中T细胞比例增加，两组之间的其他细胞类型没有显著差异，具体见图1C。
图1.UMAP聚类分析和细胞注释结果(A和B);CR组和非CR组的各类型细胞比例(C)
在T细胞中，研究者进一步鉴定出8个T细胞亚群，包括1个NKT亚群、5个CD8亚群以及2个CD4亚群，具体见图2A，B。治疗前后各细胞亚群比例的分析结果表明，治疗后，CR组的CD8+效应T细胞比例有所增加，而非CR组有所减少，具体见图2C。研究者对CR组和非CR组进行了差异基因分析，具体结果见图2D。CR组高表达的基因富集在白细胞介导的细胞毒性、激活免疫反应和白细胞-细胞粘附正调控等功能。非CR组的基因则富集在DNA损伤、P53-介导的内在凋亡及其他相关通路，具体结果见图2E、F。
图2.T细胞亚群分析结果(A和B);CR组和非CR组T细胞亚群比例结果(C);CR组和非CR差异基因分析结果(D);CR组(E)和非CR组(F)KEGG富集分析结果。
细胞通讯分析结果表明，与非CR组相比，CR组患者基线时的细胞间通讯更频繁。此外，相较于非CR组，CR组患者的CD8效应T细胞与其他细胞表现出更多的相互作用;非CR组的治疗后的免疫抑制相关的细胞间相互作用增强。对于甲基化的分析结果，基线时，非CR组的平均甲基化水平略高于CR组，但差异无统计学意义(0.582±0.007
vs
0.578±0.021，P=0.811)。基线时，与CR组相比，非CR组存在779个高甲基化位点和350个低甲基化位点，共1129个差异甲基化探针(DMP)。基因富集分析显示，GSEA结果显示，差异甲基化位点注释的基因与激活T细胞的细胞免疫功能有关，包括趋化因子的产生、白细胞介导的细胞毒性作用和细胞杀伤。此外，KEGG分析显示，这些基因与T细胞受体信号通路和原发性免疫缺陷密切相关。
研究结论
该研究阐释了CAR-T治疗前后CR和非CR组的DLBCL患者的宿主T细胞(尤其是CD8效应T细胞)与其他免疫细胞之间存在相互作用和协同效应。纵向分析显示，积极的T细胞克隆扩增和表型转化与更好的疗效相关。T细胞内在的缺陷可能是导致DLBCL患者疗效不佳的一个重要因素，而改变宿主T细胞的表观遗传学状态以恢复正常的基因表达，可能会改善CAR-T细胞功能，进而改善CAR-T疗法的疗效。